融合双波全能型电穿孔仪

杂交瘤细胞的准备

4.1材料清单

4..1.1细胞

1对数生长期的骨髓瘤细胞

2脾脏、外周血细胞等

4..1.2细胞融合试剂

无菌0.3M甘露醇，葡萄糖或相关糖。加入0.1mMCa2+和0.1mMMg2+。

用0.1NNaOH调整pH值为7～7.3。

4..1.3细胞融合协助（可选择）

不含盐离子的过滤除菌的5mg/ml胰蛋白酶，或者不含盐离子的过滤除菌的1mg/ml链霉蛋白酶，或者g/ml钙调素和50μg/ml单椰子油甘油酯。

4..1.4设备和其它材料

1RPMI-培养基，含10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培养液。

2台盼蓝，检测细胞融合前和融合后的细胞活性.

3无菌96微孔板

46"or8".的灭菌吸管

5带有10xand40x目镜的显微镜

6可选：2个冰浴，一个用来放试剂，一个用于层流罩

7层流罩

8桌面或实验计数器

9台式离心机

10无菌锥形管

11灭菌锅

4.2建议对ECF小鼠细胞的预处理

脾细胞应该从老鼠中取出，分离细胞到含汉克平衡盐缓冲液(Hank’sBalancedSaltSolution,HBSS)的M培养基中或RPMI培养基中，将脾细胞转移到无菌试管中，让大颗粒来解决。

吸管吸取悬浮的脾细胞进入一个新的无菌试管，去除红细胞。人类细胞和其他融合细胞的制剂和细胞浓度是相同的。

4.3融合方案

最佳的融合参数的建立可能需要一段时间，必须为每个新的骨髓瘤/淋巴细胞对进行参数摸索，细胞融合通常在室温下进行融合，但是还一种方法就是在处理过程中让细胞悬浮液保持冰浴，除此之外，在实际的融合过程中，可以把融合室放在冰浴上面。融合之前立即将细胞离心，并用非电解质溶液洗涤。

4.3.1标准0.3M甘露醇中的融合

骨髓瘤/淋巴细胞这两种细胞的混合比例为1:4左右，混合的方式为1,rpm离心6分钟，从而获得细胞沉淀物，倒掉上清液，加入0.3M甘露醇，保持pH在7-7.3之间。

细胞在0.3M甘露醇中洗两遍，重新进行悬浮，使细胞的浓度达到2×/ml,细胞不能再0.3M甘露醇中保留超过两个小时。

因此，在实验过程中，它可能是必要的，多准备一些混合细胞的悬浮液。

4.3.2葡萄糖中的融合

作为一种替代标准0.3M的甘露醇，可以选择使用其他非电解质缓冲液，比如0.3M的葡萄糖，在PH值7-7.3之间进行融合。细胞在葡萄糖中保持高达4小时。

4.3.3细胞融合协助（可选择）

一个可能添加链霉蛋白酶或胰蛋白酶以除去其中的膜表面蛋白，中和可能的表面电荷。这是可取的，如果细胞难以融合。

4.4标准的0.3M甘露醇，葡萄糖和相关糖融合后方案

1融合处理后，在无菌条件下从融合室取出细胞悬液，用吸管小心吸取悬浮液到无菌的实验管中，加入10ml的RPMI培养基，或者加入含10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基，允许静置15分钟。

rpm离心细胞5分钟，除掉上清液，之后用相应的培养基悬浮细胞，用移液器移取细胞液到96孔板中，每个孔仪器0.2ml，保证每个孔细胞的浓度为2x保证96孔板的每个孔都有充足的培养基。

℃，5%CO2过夜培养。

4第二天，除掉每个孔的一半培养基，然后加入HAT培养基培养剩下的细胞，培养到第4天，7天，10天，再一次除掉每个孔的一半培养基，然后加入HAT培养基培养剩下的细胞，细胞可以补充饲养层或其他生长因素。

5每天坚持HAT选择培养基，一旦观察到克隆子的出现，用HAT选择培养基培养进行第一阶段的扩增。